В церковно-административном отношении Оренбургский край до учреждения самостоятельной епархии в конце XVIII века был подчинен по своим отдельным частям разным епархиальным центрам. Большая часть Оренбургского края, в том числе город Оренбург и все ближайшие к нему линейные крепости, находилась в ведении Казанской епархии. Только Сибирско-Зауральная часть Оренбургского края, или иначе г. Челябинск и Троицк со всеми уездными церквями, принадлежали к Тобольской епархии.
В 1799 году по Высочайше утвержденному 16 октября докладу Священного Синода в пределах Оренбургской губернии была учреждена самостоятельная епархия. Ей определено было именоваться по губернии — Оренбургской, а епископу ее — Оренбургским и Уфимским.
В состав епархии вошли города с уездами, или по прежнему названию округами: Оренбург, Стерлитамак, Уфа, Бирск, Мензелинск, Бугульма, Бугуруслан, Бузулук, Сергиевск и Белебей, и затем — г. Челябинск, Троицк и Верхнеуральск. Местопребывание архиерея и консистории назначено было не в губернском городе Оренбурге, а в центральном по местоположению в епархии, хотя и уездном, — г. Уфе.
Первым епископом Оренбургским и Уфимским стал архимандрит Юрьевского монастыря и ректор Новгородской семинарии Амвросий (Келембет). Его хиротония была совершена 13 ноября 1799 г., а 18 ноября он получил официальный указ о формировании новой епархии. (см. «Общий взгляд на историю Оренбургской епархии», альбом «Край Оренбургский. Стопами православия». Оренбург, 2006, с. 9,)
Епархия несколько раз, в зависимости от изменения географических границ губернии, области и названия областного центра, меняла свое название. С 1799 г. это епархия Оренбургская и Уфимская, с 1859 г. — Оренбургская и Уральская, с 1908 г. — Оренбургская и Тургайская, затем, около 1920 г. — Оренбургская, после 1939 г. — Чкаловская, с июля 1945 г. — Чкаловская и Бузулукская, с 1957 г. — Оренбургская и Бузулукская.